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              利用離心機提取乳酸脫氫酶及輔酶得方法

              發布時間:2021-11-24 來源:本站

              本實驗以乳酸為底物。用新鮮的動物肝臟或肌肉組織的粗制提取液,分別制成酶蛋白部分(用白陶土吸附除去輔酶Ⅰ)和輔酶部分(加熱破壞酶蛋白),觀察兩者單獨作用及共同作用的情況。實驗中為了便于觀察,用甲烯蘭(美蘭)作為受氫體,已知甲烯蘭能從還原型黃酶接受氫而由藍色變成白色(甲烯白)。所以本實驗中根據溶液藍色的消褪情況判斷乳酸脫氫反應的發生。


                實驗器材


                水浴鍋;離心機;離心管;試管;研缽;剪刀;鑷子;實驗動物(小鼠、大鼠或兔)。


                實驗試劑


                1.玻璃砂 充分洗凈。


                2.0.1MpH7.4磷酸緩沖液 稱取Na2HPO411.92g,KH2PO42.18g,加水定容至1升。


                3.白陶土 用于吸附輔酶Ⅰ。


                4.0.5%KCN液 稱取KCN 0.5g,加水溶解成100ml。


                5.5%乳酸鈉溶液 稱取乳酸鈉5g,加水溶解成100ml。


                6.0.04%甲烯蘭液 稱取甲烯蘭0.04g,加水溶解成100ml。


                實驗方法


                1.分別制備酶蛋白提取液及輔酶Ⅰ提取液


               ?。?)除去輔酶Ⅰ的酶蛋白提取液:取新鮮動物肝(或肌肉)組織3g,剪碎放研缽中加玻璃砂約0.5g,白陶土0.5g,加pH 7.4 0.1M磷酸緩沖液8ml,研成細粥狀。移入離心管中,以2000rpm離心機離心5min,傾于另一試管中備用。


               ?。?)輔酶Ⅰ提取液:取蒸餾水10ml于中試管中,加熱煮沸。取新鮮的肝(或肌肉)組織3g,剪碎,放入沸水中,繼續煮沸10min,為防止水分過多蒸發可加蓋。稍冷后傾入乳缽中研細,移入離心管中放入離心機離心10min,取上清液備用。


                2.取試管4只,標明管號,按下圖表加樣:


                3.充分混勻,向各管徐徐加人液體石蠟5滴(避免與空氣接觸),靜置試管架上或放37℃水浴15~30min,隨時觀察并記錄各管褪色情況,分析結果。


                注意事項:


                1.KCN劇毒,注意安全。


                2.乳酸脫氫生成的丙酮酸與KCN結合,防止可逆反應發生。


                3.本實驗中生成的甲烯白易被空氣氧化又轉變成甲烯蘭,所以在加入液體石蠟后觀察褪色時不宜振蕩。


                4.  離心機選擇合適轉數,使用注意安全。


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